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Bio-techne|做好 ELISA 的小细节,摇床你用对了吗?

在 ELISA 实验所需的简单仪器中,摇床是个迷惑的存在,科研猿们经常在是否需要使用中举棋不定。大多数的 ELISA 实验是不需要使用摇床的,室温孵育即可,但有些特殊的 ELISA 不但需要摇床,且有严格的使用参数。

在 R&D Systems® ELISA 试剂盒说明书中,其实早有答案,以 Human IL-6 Quantikine HS ELISA Kit(货号 HS600C)为例,操作流程(Assay procedure)部分中提到:

这里,建议使用 500 rpm,0.12" orbit 参数的摇床/振荡器。

 

  • 摇床长什么样?为什么需要使用摇床?

众所周知,实验室里通常有各种用途及规格的摇床,如用来培养细菌、动物细胞及用于 Western Blot 抗体孵育的摇床等。

我们 ELISA 说明书中要求的摇床类似下图,该摇床专为 96 孔板设计,轨道直径 3 mm,转速可达到 500±50 rpm,运行时快速振动,且顶部托盘有微孔板固定装置,微孔板既不会松脱,也不会有液体飞溅。

 

 

如果在 ELISA 产品说明书中要求使用摇床,则必须使用,否则会影响抗原抗体的有效结合,导致待测孔的 OD 值偏低。

例如使用 Human/Mouse/Rat Activin A Quantikine ELISA Kit(货号 DAC00B),在未使用摇床时得到的标准品 OD 值(450 nm 的测定值减去 570 nm 的测定值)异常(表 1)。

结果显示,最高浓度(1,000 pg/mL)的标准品平均 OD 值仅为 0.647,且 125pg/mL 标准品两个复孔 OD 值相差较大,低浓度标准品 OD 值无明显梯度。因而无法保证检测结果的准确性。而在使用了摇床的实验中,标准品 OD 值正常(表 2)。

 

  • 是否必须使用指定参数的摇床?可以用其它规格代替吗?

由于说明书中指定的轨道直径 3 mm,转速 500±50 rpm 的摇床是我们验证过的能保证准确结果的摇床,而其它摇床,如 Western Blot 实验中使用的水平摇床轨道直径较大,如果设置成 500rpm 就会转速太快,容易造成微孔板内液体飞溅、样品孔污染,进而影响实验结果的准确性。

 

如果您希望使用其它规格的摇床尝试,可进行如下操作:

将适量体积的液体加入备用 96 孔微孔板,用封口膜覆盖孔板;

调整摇床速度,让液体剧烈振荡,使其几乎旋转到微孔板的顶部,但不能形成气泡或飞溅到封板膜上;

使用 R&D Systems® 的试剂盒做一次标准曲线,验证一下实验结果是否可以接受。

 

但这种测试需要耗费额外的孔板及时间,得不偿失,所以最好还是根据说明书的建议选择摇床。

小小的摇床,却关乎实验的成败。当我们准备开展实验时,不妨多研读一番说明书,不要错过其中的细枝末节。

 

以上文字和图片来源于Bio-techne

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